مطالعه سیتوژنتیک گیاهان

چکیده

مطالعه سیتوژنتیک گیاهان به‌منظور تعیین سهم هریک از صفات کاریوتیپی در ایجاد تنوع گونه‌های مختلف گیاهان انجام می‌گیرد. برای تهیه نمونه کروموزومی مناسب ۵/۰ سانتی‌متر نوک ریشه را جدا و پس از پیش‌تیمار نوک ریشه، تثبیت، هیدرولیز، رنگ‌آمیزی و اسکواش می‌کنیم و بعد صفحه گسترش متافازی مناسب انتخاب می‌کنیم و در نهایت عکس‌برداری و تهیه کاریوتیپ به‌منظور بررسی مورفولوژی کروموزوم‌ها انجام می‌شود. با تعیین عدد پایه کروموزومی در تمام ژنوتیپ‌های موجود، جدول دوطرفه استیبنز تکمیل و کلاس موردنظر مشخص می‌شود. همچنین با اندازه‌گیری پارامترهای مختلف کاریوتیپی L (طول بازوی بلند کروموزوم)، S (طول بازوی کوتاه کروموزوم)، T (طول کل کروموزوم) و تفاوت کروموزوم‌های اکوتیپ‌های مختلف بررسی می‌شود. سپس دامنه تغییرات شاخص‌ هازیوارا (%F)، دامنه تغییرات طول نسبی کروموزوم (%RL) و تقارن کاریوتیپ براساس روش‌های %TF ،%DRL و %S برای اکوتیپ‌های موجود محاسبه و آنالیز می‌شود.

مقدمه

انجام مطالعات سیتوژنتیک در گیاهان بومی و وحشی اهمیت زیادی دارد. اولین قدم در جهت شناخت خصوصیات ژنتیک یک گیاه، تشخیص وضعیت کروموزوم‌های آن است. به کمک اطلاعات کروموزومی، امکان مقایسه گونه‌ها و جمعیت‌ها فراهم می‌شود. هر یک از جمعیت‌های متعلق به یک گونه، سازش ژنومی خاص خود را با محیطی که در آن می‌رویند، نشان می‌دهد. با افزایش اختلافات سازشی ممکن است واریته‌های جدید و حتی گونه‌های جدید در رویشگاه‌های گیاهی به‌وجود آیند. بنابراین، کروموزوم‌ها عوامل مناسبی هستند که می‌توان براساس آن‌ها روند تکاملی گیاهان را تعیین کرد (5، 14، 15 و 16).

پس از تعیین عدد پایه کروموزومی در جنس گیاه موردنظر، سطح پلوئیدی برای گونه‌های مورد مطالعه تعیین می‌شود. مطالعات کاریوتیپی به‌منظور مقایسه اختلاف موجود و آشکار شدن سیر تکاملی در کروموزوم‌های تشکیل‌دهنده ژنوم انجام می‌گیرد. اهمیت مطالعات سیتولوژیک به این موضوع برمی‌گردد که کروموزوم‌ها حامل ژن‌ها هستند و آن‌ها اطلاعات ژنتیک مربوط به فنوتیپ گیاه را دارند (13). با توجه به اینکه خصوصیات گیاهی تا حدود زیادی تحت کنترل مواد ژنتیک هسته‌ای است؛ بنابراین، یکی از روش‌های بررسی تنوع در ارقام و گونه‌های مختلف گیاهی، انجام مطالعات سیتوژنتیک و کاریوتیپی است. بدیهی است گونه‌هایی که از لحاظ پارامترهای سیتوژنتیک و خواص کروموزومی به هم شبیه هستند، در بحث روابط بین گونه‌ای قرابت بیشتری دارند و در صورت وجود صفات مطلوب در این گونه‌ها امکان تلاقی بین‌گونه‌ای برای جمع‌آوری ژن‌های مطلوب در یک گیاه وجود خواهد داشت (17). اولین قدم در شناخت ژنوم یک گونه مطالعه تعداد، شکل و رفتار کروموزوم‌های آن است (3).

در این مقاله سعی شده با استفاده از روش‌های آماری چندمتغیره، تشخیص و تفکیک ژنوتیپ‌ها دقیق‌تر صورت گیرد؛ لذا مهم‌ترین اهداف این بررسی عبارت‌اند از:

۱. تعیین کاریوتیپ، شکل، اندازه کروموزوم‌ها و تعیین سطح پلوئیدی ژنوتیپ‌ها؛

۲. گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها با در نظر گرفتن کلیه پارامترهای کاریوتیپی و تعیین قرابت و دوری ژنوتیپ‌ها؛

۳. تعیین سهم هر یک از صفات کاریوتیپی در ایجاد تنوع بین ژنوتیپ‌ها؛

۴. تعیین والدین جهت تلاقی و معرفی بهترین هیبرید با توجه به ژنوتیپ‌های موجود.

اولین قدم در جهت شناخت خصوصیات ژنتیک یک گیاه، تشخیص وضعیت کروموزوم‌های آن است

مواد و روش‌ها

برای تهیه نمونه کروموزومی مناسب به روش اسکواش مراحل زیر اجرا می‌شود:

۱. جمع‌آوری ریشه

در این مرحله بذرها را به‌طور منظم و در فاصله‌های یک سانتی‌متری روی کاغذ صافی درون ظرف پتری قرار می‌دهیم و سپس ظرف پتری را با پارافیلم به‌طور کامل می‌بندیم. ظرف‌های پتری به ‌مدت یک تا دو روز در یخچال و سپس برای ادامه جوانه‌زنی به محیط دارای دمای 25-20 درجه سانتی‌گراد منتقل می‌شوند. بعد از سه الی چهار روز که طول ریشه‌ها به یک تا دو سانتی‌متر رسید، آن را برمی‌داریم و نیم سانتی‌متر از نوک ریشه را برای انجام مراحل بعدی به‌وسیله تیغه جدا می‌کنیم.

۲. پیش‌تیمار ریشه

برای پیش‌تیمار ریشه از محلول اشباع آلفا برومو نفتالین و در صورت ریز بودن کروموزوم‌ها از محلول 8-هیدروکسی کینولین استفاده می‌شود. ریشه‌ها را به مدت دو تا چهار ساعت درون یکی از این محلول‌ها قرار می‌دهیم. زمان مطلوب برای به دام انداختن کروموزوم‌ها در متافاز با تکرار پیش‌تیمار در زمان‌های مختلف به‌دست می‌آید.

۳. تثبیت ریشه

برای تثبیت ریشه‌ها از محلول تثبیت‌کننده کارنوی- 1 استفاده می‌شود. ریشه‌ها را پس از طی دوره پیش‌تیمار به ‌خوبی با آب مقطر می‌شوییم و سپس به مدت 18 الی 24 ساعت در اپندروف‌های حاوی تثبیت‌کننده در دمای یک تا چهار درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌کنیم.

۴. هیدرولیز ریشه

ریشه‌ها در کلریدریک اسید نرمال در دمای محیط به ‌مدت 20 دقیقه قرار می‌دهیم تا بافت‌های ریشه نرم و نتیجه

مورد نظر حاصل شود.

۵. رنگ‌آمیزی ریشه

انتهای مریستمی ریشه پس از تثبیت و هیدرولیز از اسیدکلریدریک خارج و پس از شست‌وشوی کامل با آب مقطر به‌وسیله آب مقطر و دستمال کاغذی به خوبی آب‌گیری و برای رنگ‌آمیزی آماده می‌کنیم. در این مرحله ریشه‌ها به مدت 45 دقیقه در دمای محیط درون استواورسئین قرار داده می‌شوند.

۶. اسکواش

بعد از رنگ‌آمیزی، نوک ریشه را با تیغ جدا و بافت مریستمی نوک آن را با سوزن آزمایشگاه خرد و له می‌کنیم. یک قطره اسید استیک 45% به نمونه‌های موجود در روی لام اضافه و آن‌ها را روی اسید استیک له می‌کنیم. لامل را روی نمونه قرار می‌دهیم و با انتهای خودکار چند ضربه آهسته (به‌طوری‌که لامل حرکت نکند) به لامل می‌زنیم. گستره نازکی از سلول‌های متلاشی شده ایجاد می‌شود که برای مشاهده صفحه متافازی در زیر میکروسکوپ قرار می‌گیرد.

۷. عکس‌برداری و تهیه کاریوتیپ

پس از اسکواش اسلاید آماده را به‌وسیله فتومیکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌دهیم و پس از عکس‌برداری از نمونه مطلوب، تصاویر را برای تحلیل آماری مورد استفاده قرار می‌دهیم ( 2 و 9).

پس از اسکواش اسلاید آماده را به‌وسیله فتومیکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌دهیم و پس از عکس‌برداری از نمونه مطلوب، تصاویر را برای تحلیل آماری مورد استفاده قرار می‌دهیم

نتایج

با استفاده از اطلاعات به‌دست آمده از اندازه‌گیری بازوی بلند(L) و بازوی کوتاه(S) کروموزوم‌های متافازی اکوتیپ‌های مورد مطالعه، پارامترهای کاریوتیپی زیر را محاسبه می‌کنیم.

• شاخص درصد شکلی کلی(%TF) ¹ که به‌عنوان شاخص دسته بندی کاریوتیپی است (%TF= مجموع طول کل کروموزوم/ مجموع طول کل بازوهای کوتاه× 100) (6).
• شاخص ارزش r²: نسبت طول بازوهای بلند(L) به بازوهای کوتاه(S)کروموزوم (8).
•  شاخص نسبت بازوها³: برای بررسی و تعیین تغییرات و اختلافات مورفولوژیک کروموزوم براساس محل سانترومر معرفی شده است که از نسبت طول بازوی کوتاه کروموزوم به طول بازوی بلند کروموزوم محاسبه می‌شود (8).
• شاخص اختلاف طول دو بازوی کروموزومی⁴: براساس اختلاف طول بازوی بلند و بازوی کوتاه به‌دست می‌آید(L-S) (7).
• شاخص %F : این شاخص برای تعیین و تشخیص وضعیت تقارن کاریوتیپ پیشنهاد می‌شود(%F=S/T×100) (6).
• طول نسبی کروموزوم(%RL): از این شاخص نیز برای تشخیص و تعیین تقارن کاریوتیپی استفاده می‌شود (100×طول کل کروموزوم/ طول کروموزوم= طول نسبی) (2 و 9).
• اختلاف دامنه طول نسبی( %DRL): از اختلاف دامنه طول نسبی کروموزوم‌ها به‌عنوان شاخصی برای مقایسه تقارن کاریوتیپ‌ها استفاده می‌شود (طول نسبی می‌نیمم ـ طول نسبی ماکزیمم = %DRL) (2و 9).
• طول نسبی کوتاه‌ترین کروموزوم(%S): این شاخص نیز برای تعیین و مقایسه تقارن کاریوتیپ‌ها کاربرد دارد (100×  طول کل کروموزوم/ طول کوتاه‌ترین کروموزوم= طول نسبی کوتاه‌ترین کروموزوم) (1).

در نهایت با استفاده از اطلاعات موجود کاریوگرام و ایدیوگرام اکوتیپ‌های مربوطه را ترسیم می‌کنیم. به‌منظور تشخیص وجود تفاوت بین کاریوتیپ‌ها، داده‌های کاریوتیپی در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی با تعداد تکرار متفاوت مورد تجزیه واریانس قرار می‌گیرد. مقایسه میانگین صفات مختلف با استفاده از آزمون دانکن انجام می‌شود و برای تعیین جایگاه ژنوتیپ‌های مختلف از تجزیه کلاستر به روش وارد و معیار فاصله اقلیدسی استفاده می‌شود. بررسی رابطه همبستگی بین کاریوتیپ‌ها با استفاده از ضریب همبستگی پیرسون و در نهایت جهت تعیین سهم هریک از صفات کاریوتیپی در ایجاد تنوع بین ژنوتیپ‌ها تجزیه به عامل‌ها به روش مؤلفه‌های اصلی انجام می‌شود.

در این مقاله سعی شده با استفاده از روش‌های آماری چندمتغیره، تشخیص و تفکیک ژنوتیپ‌ها دقیق‌تر صورت گیرد

بحث و نتیجه‌گیری

در بررسی کاریوتیپ، متفاوت بودن اندازه کروموزوم‌ها نشانه یک کاریوتیپ پیشرفته و دارای کروموزوم‌هایی با اندازه مختلف است (18). اندازه بزرگ کروموزومی ممکن است ناشی از تکرار در مکان‌های ژنی و در سری‌های مختلف باشد که خود نشانگر حرکت به‌سوی سازگاری است؛ البته، عکس این مطلب نیز صادق است؛ چرا که مضاعف شدن ژن‌ها به‌صورت عرضی، همراه با کوتاه شدن کروموزوم‌ها در گونه‌های مختلف بعضی از جنس‌هاست (12). هم‌چنین اقلیم‌های متفاوت ممکن است با افزایش اختلافات سازشی همراه باشند و این منجر به تولید واریته‌های جدید و حتی گونه‌های جدید در رویشگاه‌های گیاهی می‌شود ( 5، 14، 15 و 16). برای اینکه یکسان بودن ژنوتیپ‌ها مورد تأیید قرار گیرد، لازم است تا آزمایش‌های گیاه‌شناسی و مولکولی بیشتر و دقیق‌تری صورت گیرد تا صحت‌وسقم این مسئله معلوم شود. مکانیسم کاهش در تعداد کروموزوم‌ها با اطمینان بیشتری نسبت به کاهش در اندازه کروموزوم‌ها شناسایی شده و در نمونه‌های متعددی نشان داده شده که این وضع باعث به‌وجود آمدن کاریوتیپ‌های نامتقارن و با اندازه‌های متفاوت می‌شود که این خود نتیجه تکامل گونه‌های مورد مطالعه است (11). نامتقارتی کاریوتیپ احتمالاً به ‌علت وقوع تغییرات ساختاری کروموزوم از قبیل حذف کروموزومی، یا جابه‌جایی‌های نابرابر و غیره است. کاریوتیپ‌های متقارن معمولاً ابتدایی است و گرایش به‌سوی نامتقارن بودن از طریق واژگونی‌های پری‌سانتریک و جابه‌جایی نابرابر قسمت‌هایی از بازوهای کروموزوم بدون تغییر در تعداد سانترومرها و کروموزوم‌های مستقل صورت می‌گیرد. گرچه عکس این گرایش با جوش خوردن کروموزوم آکروسانتریک و تلوسانتریک و ایجاد کروموزوم‌های متاسانتریک صورت می‌گیرد (4 و 15).

نامتقارتی کاریوتیپ احتمالا به علت وقوع تغییرات ساختاری کروموزوم از قبیل حذف کروموزومی، یا جابه‌جایی‌های نابرابر و غیره است

در نهایت تعیین سطح پلوئیدی گونه‌های مختلف گیاهان برای انتخاب والدین در برنامه‌های دورگه‌گیری از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. چنانچه بین ژنوتیپ‌های متعلق به گونه‌های متفاوت با سطح پلوئیدی یکسان تلاقی صورت گیرد، احتمال به‌وجود آمدن هیبریدهای مناسبی خواهد بود؛ زیرا در بحث روابط بین گونه‌ای قرابت بیشتری داشته و در صورت وجود صفات مطلوب در این گونه‌ها امکان تلاقی بین‌گونه‌ای برای جمع‌آوری ژن‌های مطلوب در یک گیاه وجود خواهد داشت(17).

پی‌نوشت‌ها

1. Total Form percentage

2. r-value

3. rrm ratio

4. d-value 

منابع

1- Aksu, N., Inceer, H., Hayirlioglu- Ayaz, S., 2013. Karyotype analysis of six Achillea L. (Asteraceae, Anthemideae) taxa form Turke. Caryologia: International Journal of Cytology, Cytosystematics and Cytogenetics, 66 (2): 103-108.

2- Alishah, O., Omidi, M., 2008. Laboratory Methods of Cytogenetics. Tehran University Press, Tehran, Iran. (In Farsi). PP: 188.

3- Estilai, A., Hashemi, A., 1990. Chromosome number and Meiotic behavior of cultivated Chia, Salvia, hisponica. Hort science, 25(12): 1646- 1647.

4- Evans, G. M., 1968. Nuclear changes in flax. Heredity, 23: 25- 38.

5- G0ldblatt, P. 1987. Index to Plant Chromosome Numbers 1984- 1985. Monogr. Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 23: 1- 264.

6- Huziwara, Y., 1962. Karyotype analysis  in some genera of composite. VIII. Further studies on the chromosome of Aster. American Journal of Botany, 49: 116- 119.

7-Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. A., 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosome. Hereditas, 52(2): 201- 220.

8-Mathew, P., Mathew, M. A., 1983. Studies on the South Indian Compositae V. Cytotaxonomic consideration of tribes Vernonieae and Eupatorieae. Cytologia, 48: 679-690.

9-Omidi, M., Alishah, O., Samanfar, B., 2009. Plant Cytogenetics. Tehran University Press, Tehran, Iran. PP: 764. (In Farsi).

10-Rawashdeh, I. M., Haddad, N. I., Amir, A., 2009. Genetic Diversity Analysis of Achillea fragrantissima (Forskal) Schultz Bip. Populations from Jordan Using Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Dirasat, Agricultural Sciences, 36(2): 89-99.

11- Saeedi, K., Jalili, A., Azarnivand, H., Ghamari Zareh, A., 2005. Karyotypic study of the species of Artemisia genus in West Azerbaijan Province. Natural Resources Research and Development 67: 2-10.( In Farsi).

12-Sharma, A., Sen, S., 2002. Chromosome Botany. Science publication, Inc. Enfield, USA, pp. 41-53.

13- Skula, P., Misra, S. P., 1994. An introduction to taxonomy of Angiosperms. Vikas publishing house pub. Ltd. New Dehli.

14- Stebbins, G. L., 1950. Variation and evolution in plants. Clumbia University press, New York.

15- Stebbins, G. L., 1971. Chromosomal evolution in higher plants. Edward Arnold Press, London.

16- Stuessy, T. F., 1990. Cytology, Genetics and cytogenetics in plant taxonomy. Columbia University Press, New York.

17- Swanson, K. P., Mertz, T., Young, W. J.,1997. Cytogenetic- chromosome in division, inheritance and evolution. Translation: c. Ahmadian Tehrani. Tehran University Press, PP: 702.

18- Torrell, M., Gracia Jacas, N., Susanna, A., Valles, J., 1999. Phylogeny in Artemisia( Asteraceae, Anthemideae) inferred from nuclear, ribosomal DNA(ITS) sequences. Taxon, 48: 721-736.

فاطمه افشاری

کارشناس ارشد زیست‌شناسی علوم گیاهی

دبیر زیست‌شناسی شهرستان درمیان